Den socialt udstødte teenager Peter (Andrew Garfield) bruger sin fritid på at forsøge at optrævle mysteriet om sin egen fortid og vinde sin skolekæreste Gwen Stacys (Emma Stone) hjerte. En mystisk dokumentmappe, der har tilhørt hans far, som forlod ham, da han var lille, fører Peter til farens tidligere samarbejdspartner dr. Connors. Afsløringen af farens hemmelighed kommer til at være afgørende for Peters uundgåelige beslutning om at blive "Spider-Man" og fører til en konfrontation med dr. Connors forbryderiske alterego, The Lizard.